人們已經建立了多種干預方法來控制食品中的腐敗或致病菌，例如高靜水壓、電解氧化水、超聲波、輻射、某些化學品或精油。高靜水壓（HHP）是一種非熱食品滅菌和保鮮技術，可以在不損害產品感官質量的情況下減少微生物。在典型的 HHP 程序中，食品被密封并放入裝有壓力傳輸介質的鋼室中，并使用泵來產生壓力。HHP對食品滅菌和保鮮的效果會受到處理壓力、處理時間和傳壓介質的影響傳統上，HHP多采用普通水作為傳壓介質，但也有研究表明，改變傳壓流體可能會改善HHP的傳壓介質。HHP 的滅活作用。
近年來，次氯酸/酸性電解水（AEW）被認為是一種有效的消毒劑，并廣泛應用于許多國家的食品行業。通過在特定裝置中電解，稀釋的氯化鈉溶液解離成 AEW，其 pH 值較低，為 2-3，氧化還原電位 (ORP) > 1100 mV，活性氯含量 (ACC) 為 10 –90 ppm。與傳統消毒劑相比，AEW不僅具有更好的殺菌效果，而且對公眾健康和環境的不利影響較小。前期研究證明AEW與其他干預方法相結合可以顯著提高其滅活效率。然而，目前還沒有研究報道AEW可以作為HHP的新傳輸介質。此外，AEW 對 HHP 滅活效率的影響尚不清楚。
本研究首次開發了一種利用HHP結合AEW作為新型傳輸介質的新型滅菌保鮮技術（AEW-HHP）。應用響應面 (RS) 模型來量化 AEW 對高靜水壓加工的影響，以減少帶殼鮮蝦的致病菌。并通過去殼鮮蝦原生菌群的減少和肌纖維的變化來評價新技術的保鮮效果。這種新穎的滅菌保鮮技術可以為消除病原微生物、提高海產品質量和安全提供有力的工具。
菌株和培養物制備
副溶血性弧菌菌株（ATCC 17802；ATCC 33847；F 18，凡納濱對蝦分離株；F 36，血清型 O3：K6）的四菌株混合物和單核細胞增生利斯特氏菌（ATCC 19115；ATCC 19116）的兩菌株混合物研究中使用。將副溶血弧菌的每種菌株（-80°C 儲存于 25% 甘油中）分別在胰蛋白酶大豆肉湯加 3% NaCl 中培養，并在 37°C 下孵育18小時。單核細胞增生利斯特氏菌的其他菌株在 37°C 的 TSB 中生長 18-20 小時。將富集的培養物匯集到無菌離心管中，并在 3000 g、25°C 下離心 10 分鐘。將沉淀的細胞重懸于無菌蛋白胨水（PW；0.85% 氯化鈉，0.1% 蛋白胨）中，以獲得副溶血弧菌和單核細胞增生李斯特菌分別約為 9 log 10 CFU/ mL的多菌株混合物。
蝦樣品的制備和接種
每次實驗前，從海鮮市場購買活的新鮮蝦（凡納濱對蝦），并裝在塑料袋中運送到實驗室，塑料袋中裝有充有氧氣的池塘水，以保持蝦的活力。在實驗室，按照GB/T 4789.7-2008（中國國家標準規范，2008）中描述的方案，用自來水沖洗蝦。將蝦斬首、去皮并在紫外線下消毒30分鐘。將去殼鮮蝦樣品（每只蝦 7 ± 1 g）浸泡在 200 mL 含有四種副溶血性弧菌菌株（或兩種單核細胞增生李斯特氏菌）的懸浮液中。菌株）30 分鐘，然后轉移至塑料板 30 分鐘以允許細菌附著。上述方案在室溫（23±2°C）下進行。接種后的蝦用于后續處理。
酸性電解水（AEW）的制備
使用AEW發生器通過電解不同濃度的氯化鈉（電解的氯化鈉濃度；表1 ）來制備具有不同物理化學特性的AEW。在收集水之前，讓發生器運行 15 分鐘，電流強度設置為 10 A。pH 和 ORP 使用 pH/ORP 計測定。AEW 中的 ACC 使用數字氯測試套件（RC-2Z，Kasahara Chemical Instruments Corp.，Saitama，Japan）通過比色法測定。所有測量均一式三份進行。AEW 的 pH 范圍為 2.28–2.39，ORP 1077–1168 mV，ACC 36–73 mg/L。
表1 BOX-BEHNKEN 實驗設計所用變量的代碼和級別
高靜水壓 (HHP) 治療
本研究使用高壓食品加工機。上升速率約為 240 MPa/min，壓力釋放時間幾乎是立即的。將樣品包裝在無菌塑料袋中，并在所需水平 200、300 或 400 MPa 下進行處理，處理時間為 5、10 或 15 分鐘。HHP采用普通水或AEW作為傳輸介質。
細菌計數
本研究采用的細菌計數方法是根據既往研究的平板計數法。簡而言之，將蝦樣品在胃攪拌器（BagMixer）中均質化 2 分鐘。然后，使用直接平板法對蝦樣品上的副溶血性弧菌、單核細胞增生利斯特氏菌和本土微生物群落進行計數。TCBS 瓊脂用于副溶血弧菌，PALCAM 瓊脂用于單增李斯特菌分別使用胰蛋白酶大豆瓊脂作為本土微生物群。直接平板法的檢測限約為 2 log 10 CFU/g。將平板在 37°C 孵育 24 小時后進行菌落計數。每個采樣時間進行三次重復。
響應面模型開發和驗證
基于 Box-Behnken 實驗設計 (BBD) 的 RS 方法用于描述副溶血性弧菌滅活的三個技術變量之間的關系和相互作用（表1 ） 。使用 Design Expert 軟件包（版本 8.0.6，Stat-Ease Inc.）設計處理條件（表2），進行回歸分析并生成二階多項式模型。蝦樣品在不同條件下進行處理（表2），響應值表示為處理后的Log 減少量。
表2 根據 BOX-BEHNKEN 實驗設計安排，通過響應面模型對蝦副溶血弧菌的實際和預測減少量。
進行方差分析 ( ANOVA ) 和相應的事后對比，以比較不同實驗條件的結果。使用確定系數（R 2）、Fisher F檢驗和失擬檢驗的P值來評估模型的統計顯著性和擬合優度。描述副溶血性弧菌滅活的 RS 模型的準確性通過以下標準進行評估：準確性因子（Af，方程 1）、偏差因子（Bf，方程 2）和均方根誤差（RMSE，方程 1） 3
其中obs為觀測值，pred為RS模型預測值，n代表觀測值的數量。理想情況下，預測模型應具有Af = Bf = 1。響應曲面圖和等高線圖用于描述變量的個體效應和相互作用。
為了驗證該模型，我們進行了八項隨機組合四個變量的額外試驗（表3）。對蝦的細菌滅活方法與之前所解釋的滅活處理相同。所選參數在實驗設計的原始范圍內，但未納入模型的建立。觀察到的結果用于通過Ross (1996)提出的Af（公式 1）和Bf （公式 2）來評估模型的性能。
表3 在額外的隨機八個條件下，帶殼鮮蝦副溶血弧菌滅活的實際和預測減少值。
AEW-HHP處理在人工污染帶殼鮮蝦上的應用
通過RS方法獲得了AEW-HHP對人工污染蝦細菌滅活的最佳條件。根據最佳條件，對人工污染的副溶血性弧菌或單核細胞增生利斯特氏菌污染的帶殼鮮蝦樣品進行AEW-HHP處理。處理條件設定為電解氯化鈉濃度1.5 g/L，處理時間10 min，處理壓力200、300、400 MPa。如上所述通過平板接種測定細菌減少。
掃描電子顯微鏡 (SEM) 觀察
經過AEW-HHP處理后，通過SEM觀察人工污染的帶殼鮮蝦上的細菌。樣品的制備和觀察均按常規方法進行。簡而言之，將處理后的人工污染蝦樣品用2.5％戊二醛固定，然后在分級乙醇系列中脫水，涂上金鈀（離子濺射和碳涂層裝置E-1045）并在掃描電子下觀察顯微鏡。
AEW-HHP處理在自然污染帶殼鮮蝦上的應用
為了進一步驗證滅活效果，應用AEW-HHP處理來消除自然去殼鮮蝦上的本土微生物群落。處理條件設定為電解氯化鈉濃度1.5 g/L，處理時間10 min，處理壓力200、300、400 MPa。使用 TSA 對本地微生物區系進行細菌計數。采用PCR-DGGE分析對蝦的細菌多樣性，并通過組織學分析評價對蝦的品質。
使用 PCR-DGGE 進行細菌多樣性分析
PCR-DGGE 分析用于評估自然污染蝦上細菌多樣性的變化。根據Ampe等人描述的方法提取DNA。簡而言之，所有樣品在胃中均質化 2 分鐘。將所得懸浮液(1mL)離心(12,000g，2分鐘)，然后棄去上清液。使用DNA提取試劑盒（TIANamp細菌DNA試劑盒）提取獲得的沉淀物的DNA。一微升 DNA 樣本用作 PCR 模板。引物 V3-2 (5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3') 和 V3-3 包含一個 40 bp GC 夾 (5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCG GGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3')，用于擴增 16S rDNA 的高變 V3 區。就長度和種間異質性而言，V3 區域是一個不錯的選擇。PCR 混合物由 25 μL Premix Ex Taq 、19 μL ddH 2 O、1 μL 每種引物和 2 μL DNA 模板組成。反應在熱循環儀（Mastercycler pro S）上進行。PCR 程序根據Muyzer 等人進行。稍作修改如下：95°C 初始變性 3 分鐘；25個循環，95℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸30秒；最后在 72°C 下延伸 5 分鐘。擴增產物用 1% (m/v) 瓊脂糖凝膠電泳分離，并在紫外燈下可視化。
使用 BioRad DCode™ 通用突變檢測系統使用 20 μL 純化并濃縮的 PCR 產物進行 DGGE。將 PCR 產物涂在含有 40-55% 尿素甲酰胺變性梯度的 1 × TAE 緩沖液中的 8% (m/v) 聚丙烯酰胺凝膠上。恒溫（60℃）100V電泳10h。DGGE 凝膠用 SYBR green I 染色并在紫外光下可視化。所有測定均一式兩份進行。
使用 Image Lab分析 DGGE 凝膠的掃描圖像。香農指數通過 DGGE 帶型分析計算。細菌多樣性香農指數H ′由式(4)求得。P i按等式(5)計算。
其中P i是凝膠泳道中條帶的重要性概率，ni是峰的高度，N是光密度分布中條帶的所有峰高度的總和。
組織學分析
根據Liu D.等人的方法進行組織學分析進行了一些修改。切下蝦樣品的第二個尿節，并在4％福爾馬林中固定24小時。將組織用分級系列乙醇（70%、80%、90%、95%和100%）脫水，然后轉移到二甲苯中并包埋在石蠟中1-2小時。使用 RM2235 切片機（Leica Microsystems CMS GmbH）獲得 7 μm 的組織切片。將切片在水中重塑、干燥、脫蠟、再水合、染色（蘇木精-伊紅染色）后轉移到載玻片上，然后拍照。所有測定均一式三份進行。
根據Díaz-Tenorio 等人的方法對每張圖片進行圖像分析。空白區域代表肌纖維之間間隙的面積。計算每張圖片中空白區域的百分比。結果表示為總分析面積的百分比。
統計分析
所有值均表示為平均值±標準差（SD）。使用SPSS統計軟件包17.0（SPSS Inc.）進行統計分析。進行一種方差分析來比較不同條件下的效果。最小顯著差異 ( LSD ) 檢驗用于確定 α = 0.05 時的差異。
AEW-HHP滅活副溶血性弧菌的最佳條件
帶殼鮮蝦的初始負荷約為 7.1 log 10 CFU/g。BBD 設計了 17 項不同組合條件（電解氯化鈉濃度、處理壓力和處理時間）下的試驗。表2顯示了不同條件下帶殼鮮蝦副溶血弧菌的Log減少結果。Log 減少的實際值范圍為 2.72 至 6.03 log 10 CFU/g。
使用Design Expert包進行后向逐步回歸，根據表2建立RS模型，建立的模型如下：
其中R是響應值 (log 10 CFU/g)；X 1、X 2和X 3分別代表變量，包括電解的NaCl濃度、處理壓力和處理時間。二次模型的方差分析結果表明回歸方程的擬合優度：R 2和Adj。R 2分別為0.994和0.986。Adj.R 2的值表明觀測值和預測值之間存在高度相關性，這表明當前模型只能解釋總變異的 1.6%。RMSE 還提供了模型與用于生成模型的數據的擬合優度的度量，其值為 0.29，表明 RS 模型與觀測數據擬合良好。使用 Fisher F檢驗和失擬檢驗確定模型的統計顯著性和充分性（表4）。F值 129.49 和概率值 ( p< 0.0001）表明不同處理之間的差異非常顯著。該模型是足夠的，因為失擬檢驗 ( p > 0.05) 并不顯著。
表4 帶殼鮮蝦副溶血弧菌滅活響應面模型的方差分析 ( ANOVA ) 。
圖1A中的響應曲面圖描述了處理時間為10分鐘時氯化鈉濃度和處理壓力的滅活效果。隨著 NaCl 濃度和壓力的增加，帶殼鮮蝦上的副溶血弧菌數量顯著減少 ( p < 0.0001)。氯化鈉濃度的變化與處理時間在副溶血性弧菌滅活中起著相似的作用，并且細菌對氯化鈉濃度和時間的敏感度低于壓力（圖1B，C）。估計的最佳處理條件是 1.5 g/L NaCl 濃度，在 400 MPa 下電解 10 分鐘，最大細菌減少量為 6.08 log 10 CFU/g。
圖 1 響應面圖描述了高靜水壓和 AEW 技術變量相結合對蝦副溶血弧菌滅活的影響。(A)處理時間10 min時，氯化鈉濃度對電解( X 1 )和壓力( X 2 )對副溶血弧菌還原的影響；(B) 300 MPa壓力下，電解鹽濃度( X 1 )和處理時間( X 3 )對還原副溶血弧菌的影響；(C)壓力 ( X 2 ) 和處理時間 (X 3 ) 用電解 1.5 g/L 的 NaCl 濃度還原副溶血弧菌。
驗證是一個重要的步驟，可以評估已開發模型的能力（Bover-Cid et al., 2012）。因此，進行了外部驗證。圖2A所示的另外八個獨立實驗的結果（表3 ）用于根據方程（1-3）計算Af、Bf和 RSME。Af值為 1.03，觀察結果與預測之間僅存在 3%的差異。計算出的Bf為 1.01，位于Ross提出的 0.9-1.05 可接受范圍內。RMSE (0.19) 顯示 RS 模型的預測值與觀測數據吻合良好。
圖 2 (A)在實驗范圍內的額外隨機 8 個條件下觀察到的蝦副溶血弧菌減少量與預測減少量之間的線性相關性。(B)帕累托圖，顯示具有統計顯著性 ( p < 0.05) 的技術（獨立）變量對去殼鮮蝦副溶血弧菌AEW-HHP 滅活的影響。Beta 系數對應于回歸分析估計的標準化系數。Pre和Ti是壓力和時間的縮寫。
模型建立后，利用Pareto圖考察各變量對副溶血性弧菌滅活的相對貢獻（圖2B）。結果表明，在選定變量內，處理壓力是決定AEW-HHP對帶殼鮮蝦副溶血性弧菌滅活效果的最重要因素，自變量及其交互作用的影響排序為X 2 >X21X12> X 1 = X 3 >X23X32根據圖2B。
AEW-HHP對人工污染帶殼鮮蝦的影響
接種并在生物安全柜中干燥約1小時后，帶殼鮮蝦上的初始微生物種群副溶血弧菌和單核細胞增生李斯特菌分別為7.12和6.94 log 10 CFU / g 。圖3顯示了在200、300和400 MPa的HHP和AEW-HHP分別作用10分鐘后，去殼鮮蝦上副溶血弧菌和單核細胞增生李斯特菌的數量減少。AEW-HHP 處理的蝦和 HHP 處理的蝦的微生物種群之間存在顯著差異（p < 0.05）。所有結果表明AEW-HHP對副溶血性弧菌的滅活效果比HHP更有效和單核細胞增生李斯特氏菌，對于 AEW-HHP，在 400 MPa 下最大減少量分別約為 6.08 和 5.71 log 10 CFU/g（圖3）。
圖 3 分別經過 200、300 和 400 MPA 的 HHP 和 AEW-HHP 后，去殼鮮蝦上副溶血弧菌(A) 和單核細胞增生李斯特菌( B) 的數量減少。條形代表標準差 ( n = 3)。相同壓力內條形上的星號表示顯著差異 ( p < 0.05)。
通過SEM觀察AEW-HHP對帶殼鮮蝦細菌微形態的影響，結果如圖4所示。如圖4所示，作為對照的未經處理的蝦樣品表面存在大量副溶血性弧菌和單增李斯特菌。經過HHP處理的帶殼鮮蝦表面仍然存在一些細菌種群（圖4），而經過AEW-HHP處理后的蝦樣品表面幾乎沒有發現微生物細胞（圖4A、B）。因此，這些結果表明AEW-HHP對于減少帶殼鮮蝦的細菌具有顯著的功效。
圖 4 接種副溶血性弧菌(A) 和單核細胞增生利斯特氏菌(B)的帶殼鮮蝦經過不同處理后的微生物種群掃描電子顯微鏡 (SEM) 圖。所有處理和測定均一式三份進行。處理如下：未處理為對照；HHP處理（電解氯化鈉濃度0 g/L，處理壓力400 MPa，處理時間10 min）；AEW-HHP處理(電解氯化鈉濃度1.5 g/L，處理壓力400 MPa，處理時間10 min)。
AEW-HHP 對帶殼鮮蝦原生微生物區系的影響
圖5A報告了AEW-HHP在減少帶殼鮮蝦上的本地微生物群落方面的功效。未經處理的鮮帶殼蝦中總需氧菌的初始微生物種群為 6.72 log 10 CFU/g。HHP 處理后，在 200、300 和 400 MPa 下，微生物菌群分別減少了 0.98、3.31 和 4.29 log 10 CFU/g。與HHP相比，AEW-HHP處理的消毒效果明顯更好。200、300 和 400 MPa 的 AEW-HHP 可以分別有效減少微生物數量高達 1.47、4.33 和 5.66 log 10 CFU/g。AEW-HHP 處理的蝦和 HHP 處理的蝦的微生物種群之間存在顯著差異（p < 0.05）。
圖 5 HHP 和 AEW-HHP 處理后帶殼鮮蝦的天然微生物菌群數量減少 (A) 和細菌菌群 PCR-DGGE 指紋圖譜 (B)。條形代表標準差 ( n = 3)。相同壓力內條形上的星號表示顯著差異 ( p < 0.05)。M，標記；1、未經處理；2、HHP處理；3、AEW-HHP處理；VP，副溶血弧菌；LM，單核細胞增生利斯特氏菌；EC，大腸桿菌。
采用PCR-DGGE方法研究HHP和AEW-HHP對蝦體內微生物群落多樣性的影響。PCR-DGGE的結果如圖5B所示。DGGE 指紋圖譜清楚地表明，HHP 和 AEW-HHP 處理都會降低對蝦的細菌多樣性，而 AEW-HHP 處理的效果優于 HHP。未經處理的蝦樣品的香農指數H '為2.883，經HHP處理后該值變為2.418。令人驚訝的是，香農指數H當應用 AEW-HHP 處理蝦樣品時，' 降低至 2.064。此外，經AEW-HHP處理的微生物群落DGGE指紋的平均相似系數（0.567）低于經HHP處理的微生物群落（0.716）。因此，這些結果直接表明AEW-HHP對降低帶殼鮮蝦微生物群落多樣性具有更強的功效。
AEW-HHP對帶殼鮮蝦肌纖維的影響
圖6顯示了經AEW-HHP和HHP處理的去殼鮮蝦肌肉纖維的光顯微圖像。對照組肌纖維緊密附著，肌纖維間隙小得多，其百分比為0.532±0.043。在隨后的處理過程中，HHP（圖6B）和AEW-HHP（圖6C）的空白區域百分比分別為0.478±0.016和0.494±0.022 。根據顯微組織學分析，與對照組相比，AEW-HHP處理不僅可以減少帶殼鮮蝦的自然微生物菌群，而且對蝦的肌肉組織沒有影響（p > 0.05 ）。
圖 6 未處理的對照蝦 (A)、HHP 處理的蝦 (B) 和 AEW-HHP 處理的蝦 (C) 縱向切片的光學顯微鏡觀察。
有效的滅菌和保鮮技術是食品行業食品安全和質量的先決條件。在食品工業的制造過程中，有必要開發一種能夠顯著誘導微生物滅活并提高加工產品安全性的食品保鮮技術。在本研究中，我們成功地表明AEW可以作為一種新的傳播介質來代替普通水，以顯著提高HHP對帶殼鮮蝦的殺菌效果。這種新方法因其優異的性能在食品工業中具有廣闊的應用前景。
采用響應面法獲得了AEW-HHP滅活帶殼鮮蝦副溶血弧菌的最佳條件。模型結果表明，1.5 g/L是產生AEW的最佳NaCl濃度，最佳處理壓力和處理時間分別為400 MPa和10 min。在優化處理條件下，該方法可有效減少帶殼鮮蝦上的副溶血弧菌6.08 log 10 CFU/g。本研究開發的響應面模型有力地證明了AEW聯合HHP可以有效消除副溶血性弧菌該模型將來還可用于評估副溶血性弧菌感染風險的降低。
為了進一步驗證該AEW-HHP方法對其他細菌的滅菌性能，本研究對帶殼鮮蝦上的單增李斯特菌和本土微生物群落進行了研究。由于副溶血性弧菌滅活的最佳條件可能不適用于其他微生物，因此我們評估了 200、300 和 400 MPa 下蝦樣品中單核細胞增生李斯特氏菌和本地微生物群落的減少情況（圖3、5A ）。與普通水作為傳壓介質相比，AEW-HHP對副溶血性弧菌的滅活效果從4.74 log 10 CFU/g顯著提高至6.08 log 10 CFU/g。為了對于單增李斯特氏菌，AEW-HHP可降低5.71 log 10 CFU/g，而HHP僅可降低4.31 log 10 CFU/g。在帶殼鮮蝦上的本地微生物區系中也觀察到了類似的結果，AEW-HHP 顯示額外減少了 1.37 log 10 CFU/g。AEW-HHP 的效果明顯高于 HHP，這可能是由于殺菌技術之間的協同作用所致。AEW作為一種有效的滅菌劑，不僅被廣泛用于消除食品中的多種病原體，而且被證明是改善食品質量的可靠助手。其他干預方法的滅活效率。本研究首次揭示了AEW和HHP之間的協同作用，還需要進一步研究來探討協同作用的機制。
通過SEM進一步觀察蝦身上的微生物種群（圖4）。SEM已被證明是一種有用的工具，可以為證明治療后微生物種群的存活或死亡提供直觀證據。本研究中，SEM結果與平板計數結果一致；與 HHP 處理相比，經 AEW-HHP 處理的接種副溶血性弧菌和單核細胞增生利斯特氏菌蝦樣品表面的微生物數量減少。雖然SEM不是定量技術，但它提供了更全面的信息，清楚地顯示了AEW-HHP處理后蝦上細菌的生存情況。
除了傳統方法外，本研究還采用分子技術來評估 AEW-HHP 的效率。DGGE指紋直接證明AEW-HHP比傳統HHP在降低蝦體微生物群落多樣性方面具有更強的功效（圖5B）。先前的研究表明，微生物群落與食物腐敗有關。減少蝦上微生物多樣性的能力表明這種新方法可用于防止海鮮腐敗。此外，通過顯微組織學分析比較了未經處理、HHP 處理和 AEW-HHP 處理的蝦樣品的肌肉組織。肌肉組織的變化已被證明是食品感官質量的重要指標。結果表明，與未處理組和HHP處理組相比，AEW-HHP處理對蝦的肌肉組織沒有影響。這表明該方法可以被視為一種新興的保鮮技術，對食品感官品質的影響有限。
總而言之，本研究的各種結果表明，次氯酸/電解水 可用作新的傳輸介質，以改善 HHP 加工的滅菌和保存性能。AEW-HHP方法可以作為一種潛在的滅菌保鮮技術，降低微生物感染的風險，確保水產品安全。因此，本研究中開發的 AEW-HHP 方法可以為提高海鮮安全和保護公眾健康提供有效的工具。
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